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细胞周期时间的测定  

2015-08-12 10:27:35|  分类: 教学考试 |  标签: |举报 |字号 订阅

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细胞周期时间的测定

标记有丝分裂百分率法(percentage labeled mitosesPLM)是一种常用的测定细胞周期时间的方法。其原理是对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞,通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。

有关名词:

TG1G1期的持续时间

TG2G2期的持续时间

TSS期的持续时间

TMM期的持续时间

TC:一个细胞周期的持续时间

PLM:标记的有丝分裂细胞所占的比例

TDR:胸腺嘧啶核苷,是DNA的特异前体,能被S期细胞摄入,而掺进DNA中。通常使用的是3H或者14C标记的TDR

测定原理(图13-2):

待测细胞经3H-TDR标记后,所有S期细胞均被标记。

② S期细胞经G2期才进入M期,所以一段时间内PLM=0

开始出现标记M期细胞时,表示处于S期最后阶段的细胞,已渡过G2期,所以从PLM=0到出现PLM的时间间隔为TG2

④ S期细胞逐渐进入M期,PLM上升,到达到最高点的时候说明来自处于S最后阶段的细胞,已完成M,进入G1期。所以从开始出现MPLM达到最高点(≈100%)的时间间隔就是TM

PLM开始下降时,表明处于S期最初阶段的细胞也已进入M期,所以出现LMPLM又开始下降的一段时间等于TS

LM出现到下一次LM出现的时间间隔就等于TC,根据TC=TG1+TS+TG2+TM即可求出的TG1长度。

事实上由于一个细胞群体中TC和各时相不尽相同,第一个峰常达不到100%,以后的峰会发生衰减,PLM不一定会下降到零,所以实际测量时,常以(TG2+1/2TM-TG2的方式求出TM

细胞周期时间的测定 - 内质网 - 夏献平:生物教育互动平台

13-2 细胞周期各阶段的时间与PLM的关系

三、细胞同步化

细胞同步化(synchronization)是指在自然过程中发生或经人为处理造成的细胞周期同步化,前者称自然同步化,后者称为人工同步化。

(一)自然同步化

1.多核体

如粘菌只进行核分裂,而不发生胞质分裂,形成多核体。数量众多的核处于同一细胞质中,进行同步化分裂,使细胞核达108,体积达5~6cm。疟原虫也具有类似的情况。

2.某些水生动物的受精卵

如海胆卵可以同时授精,最初的3次细胞分裂是同步的,再如大量海参卵受精后,前9次细胞分裂都是同步化进行的。

3.增殖抑制解除后的同步分裂

如真菌的休眠孢子移入适宜环境后,它们一起发芽,同步分裂。

(二)人工同步化

1.选择同步化

1)有丝分裂选择法:使单层培养的细胞处于对数增殖期,此时分裂活跃,MI高。有丝分裂细胞变圆隆起,与培养皿的附着性低,此时轻轻振荡,M期细胞脱离器壁,悬浮于培养液中,收集培养液,再加入新鲜培养液,依法继续收集,则可获得一定数量的中期细胞。其优点是,操作简单,同步化程度高,细胞不受药物伤害,缺点是获得的细胞数量较少。(分裂细胞约占1%2%

2)细胞沉降分离法:不同时期的细胞体积不同,而细胞在给定离心场中沉降的速度与其半径的平方成正比,因此可用离心的方法分离。其优点是可用于任何悬浮培养的细胞,缺点是同步化程度较低。

2.诱导同步化

1DNA合成阴断法:选用DNA合成的抑制剂,可逆地抑制DNA合成,而不影响其他时期细胞的运转,最终可将细胞群阻断在S期或G/S交界处。5-氟脱氧尿嘧啶、羟基脲、阿糖胞苷、氨甲蝶呤、高浓度ADRGDRTDR均可抑制DNA合成使细胞同步化。其中高浓度TDRS期细胞的毒性较小,因此常用TDR双阻断法诱导细胞同步化:

在细胞处于对数生长期的培养基中加入过量TDR,(Hela2mol/LCHO7.5mol/L)。S期细胞被抑制,其它细胞继续运转,最后停在G1/S交界处。

移去TDR。洗涤细胞并加入新鲜培养液、细胞又开始分裂。当释放时间大于TS时,所有细胞均脱离S期,再次加入过量TDR,细胞继续运转至G1/S交界处,被过量TDR抑制而停止。

优点是同步化程度高,适用于任何培养体系。可将几乎所有的细胞同步化。缺点是产生非均衡生长,个别细胞体积增大。

2)中期阻断法:利用破坏微管的药物将细胞阻断在中期,常用的药物有秋水仙素和秋水仙酰胺,后者毒性较少。优点是无非均衡生长现象,缺点是可逆性较差。

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